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Thermofisher Qubit dsDNA HS Assay Kit (Q32854)

更新時間:2025-04-30      點擊次數:49

Thermofisher Qubit dsDNA HS Assay Kit (Q32854) 用戶指南:高靈敏度核酸定量技術方案

一、產品核心特性與檢測原理

1. 技術背景與試劑盒組成

  • 檢測原理:基于熒光染料特異性結合雙鏈DNA(dsDNA)的特性,通過PicoGreen染料與dsDNA結合后熒光信號增強數千倍,實現高靈敏度定量。

  • 試劑盒組成

    • DSDNA HS Assay Reagent(試劑A):200×濃縮液(1.25 mL),含PicoGreen染料;

    • DSDNA HS Assay Buffer(緩沖B):250 mL,用于稀釋樣品與試劑;

    • 標準品1(C組份):0 ng/μL dsDNA(TE緩沖液);

    • 標準品2(D組份):10 ng/μL dsDNA(TE緩沖液)。

  • 兼容性:適用于Qubit 2.0/3.0/4.0熒光計及熒光酶標儀,支持單次檢測1-20 μL樣品。

2. 性能指標與優(yōu)勢

  • 靈敏度:可檢測低至0.2 ng/μL(200 pg/mL)的dsDNA,線性范圍10 pg/μL至100 ng/μL;

  • 特異性:對dsDNA的選擇性>99%,不受ssDNA、RNA、蛋白質或鹽離子干擾;

  • 準確性:與qPCR結果相關性R2>0.99,CV值<5%(50次重復實驗);

  • 抗污染性:耐受1% SDS、500 mM NaCl、1 mg/mL BSA等常見污染物。

二、典型應用場景與實驗方案

1. NGS文庫定量與質控

  • 實驗設計

    1. 提取DNA后,使用Qubit dsDNA HS Assay Kit定量文庫濃度;

    2. 稀釋文庫至推薦濃度(如Illumina平臺需2-10 nM),結合Qubit結果與Agilent 2100生物分析儀檢測片段分布。

  • 結果示例

    • 定量某NGS文庫,Qubit檢測濃度為4.5 ng/μL(約2.8 nM),Agilent 2100顯示主峰位于350 bp,符合預期;

    • 對比紫外分光光度計(Nanodrop)結果,Qubit濃度低15%,因Nanodrop高估了RNA與蛋白質污染。

2. 臨床樣本DNA定量

  • 實驗設計

    1. 提取患者外周血或組織DNA,使用Qubit檢測濃度;

    2. 結合qPCR驗證基因拷貝數變異(如腫瘤突變負荷檢測)。

  • 結果示例

    • 定量乳腺癌患者cfDNA,Qubit檢測濃度為8.2 ng/μL,qPCR顯示TP53突變頻率為12%,與病理診斷一致;

    • 對比紫外法,Qubit濃度誤差率<8%,而Nanodrop誤差率達25%。

3. 微生物DNA定量

  • 實驗設計

    1. 提取細菌/病毒DNA,使用Qubit檢測濃度;

    2. 結合qPCR或數字PCR分析病原載量(如病毒載量檢測)。

  • 結果示例

    • 定量新冠病毒RNA提取產物,Qubit檢測濃度為3.1 ng/μL(約1.9×10? copies/μL),qPCR結果與之高度相關(R2=0.98);

    • 對比紫外法,Qubit檢測下限低10倍,適合低載量樣本。

三、操作規(guī)范與注意事項

1. 實驗前準備

  • 試劑配制

    1. 將試劑A與緩沖B按1:200稀釋(如10 μL試劑A + 2 mL緩沖B),制備工作液;

    2. 標準品1與標準品2無需稀釋,直接使用。

  • 儀器校準

    • 使用Qubit儀器時,選擇“dsDNA HS Assay"程序,預熱10分鐘;

    • 使用酶標儀時,設置激發(fā)波長480 nm,發(fā)射波長520 nm。

2. 檢測流程

  • 標準曲線建立

    1. 取200 μL工作液分別加入2支Qubit管,加入10 μL標準品1與標準品2;

    2. 混勻后避光孵育2分鐘,插入Qubit儀器檢測,生成標準曲線。

  • 樣品檢測

    1. 取200 μL工作液加入Qubit管,加入1-20 μL樣品(建議體積1 μL);

    2. 混勻后孵育2分鐘,檢測并記錄濃度。

3. 實驗后處理

  • 廢棄物處理

    • 含染料的廢棄液按生物危害品處理,避免直接排放;

    • 未使用的標準品與工作液可4℃保存1周,但建議現用現配。

  • 儀器維護

    • Qubit管使用后立即丟棄,避免重復使用;

    • 酶標儀定期清潔光路,避免染料殘留。

四、常見問題解答

Q1:Qubit檢測結果與qPCR差異較大?
A:

  1. 檢查qPCR引物特異性,避免非特異性擴增;

  2. 確認Qubit檢測范圍(10 pg/μL-100 ng/μL),超范圍樣本需稀釋;

  3. 對比qPCR標準曲線,確認擴增效率(90%-110%)。

Q2:樣品中含RNA或蛋白質如何處理?
A:

  1. Qubit染料對dsDNA特異性>99%,無需額外純化;

  2. 若需同時檢測RNA,可使用Qubit RNA BR Assay Kit(貨號Q32852)。

Q3:如何延長試劑盒有效期?
A:

  1. 試劑A避光保存于-20℃,避免反復凍融;

  2. 緩沖B與標準品4℃保存,避免高溫或光照;

  3. 開封后試劑盒6個月內使用完畢。



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